高/低表达miR-122-5p稳转PC12细胞株的构建和鉴定

陶代菊; 苏海玉; 王宇琪; 沈志强; 何波

doi:10.12307/2026.082

摘要：背景:MicroRNA-122-5p(miR-122-5p)作为微小RNA(miRNA)家族中的关键成员,在调控基因表达及多种疾病的发生发展中扮演着重要的角色,然而其确切的作用机制尚未完全阐明.构建稳定的miR-122-5p高/低表达 PC12细胞模型,可为深入研究miR-122-5p在神经系统疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具. 目的:旨在构建高/低表达大鼠miR-122-5p慢病毒载体,并以此建立稳定高/低表达miR-122-5p的PC12细胞株,为进一步研究miR-122-5p在神经系统疾病中的作用奠定基础. 方法:根据miR-122-5p基因序列设计合成引物,通过PCR扩增该基因片段.将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV369中,构建重组慢病毒质粒.筛选阳性克隆,并进行测序比对结果.将质粒载体与目的质粒载体同293T细胞共培养转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定.通过体外培养PC12细胞,确定嘌呤霉素工作浓度.慢病毒分别与PC12细胞共培养,确定转染效率,用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,RT-qPCR法检测稳定转染细胞株的miR-122-5p表达量. 结果与结论:①测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功,高表达慢病毒滴度为4×108 TU/mL,miR-122-5p低表达慢病毒滴度为1×109 TU/mL;②PC12细胞嘌呤霉素工作浓度为3.5 μg/mL;③高表达miR-122-5p慢病毒转染PC12细胞的最佳条件为HiTransG P转染增强液,且感染复数值=10;感染复数值=50时低表达miR-122-5p效率最高;④RT-qPCR结果显示,高表达稳转细胞株中miR-122-5p的表达量有明显升高,而低表达稳转细胞株中miR-122-5p表达量显著降低;⑤此次研究成功构建了高/低表达miR-122-5p慢病毒载体,并获得稳转PC12细胞株,为miR-122-5p在神经系统疾病中的进一步研究提供了实验基础.