野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定
余杉杉
林蒋国
方颖
1.华南理工大学生物科学与工程学院,广东省广州市,5100062.华南理工大学生物科学与工程学院,广东省广州市,5100063.华南理工大学生物科学与工程学院,广东省广州市,510006
摘要：背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metaloproteinase with a thrombospondin type 1 motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用.重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径.目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能.方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒.比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞.通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5％SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性.结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90％;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37％,14.70％,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致.
关键词：血管性血友病因子野生型ADAMTS13功能增强型ADAMTS13血管性血友病因子A2宿主细胞位点突变真核表达原子力显微镜生物学功能国家自然科学基金
分类号：R446(诊断学)
资助基金：国家自然科学基金(31500759)国家自然科学基金(11672109)中央高校研究项目(2017MS084)广州市科技计划(201707010062)
论文发表日期：2019-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：6( 441-446 )
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