原核融合表达载体的设计、构建及应用
程琰
毛旭虎
王庆旭
余抒
刘艳青
张晓丽
宁亚蕾
邹全明
1.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000382.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000383.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000384.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000385.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000386.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000387.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆4000388.第三军医大学检验系,临床微生物学及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心,重庆400038
摘要：目的 利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体.方法 住EspA的羧基端设计-Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点.PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA.分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E-coli BL21(DE3),IPFG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白.分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性.结果 构建的表达载体pEspA 可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的日的蛋白获得高效表达.先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性.结论 成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具.
关键词：EspA融合表达载体肠出血性大肠杆菌O157H7
分类号：R392-33(医学免疫学)
资助基金：国家十一五"863"项目(2006AA02Z443)重庆市科技攻关项目(2006BA5024)
论文发表日期：2008-01-01
在线出版日期：2025-08-15（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：7( 618-624 )
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