缺血性鼠脑中的IL-6基因表达

陈牧; 徐运

doi:10.3969/j.issn.1000-8861.2000.06.025

摘要：IL-6是一多效应的细胞因子，在宿主的防卫和急性炎症反应中起重要的作用[1]。它的表达异常和失调与多种疾病发病有关，如肿瘤、Alzheimer's病、不同类型的脑损害。为探讨 IL-6与缺血性脑损害的关系，我们用PT-PCR方法对缺血性鼠脑不同部位IL-6 mRNA表达进行了研究，报道如下： 1 材料和方法 1.1 动物模型研制 ICR小鼠18只，每组6只，雌雄各半，重 45～50 g。用线栓法研制成右侧大脑中动脉栓塞模型[2],即 25%戊拉坦1 000 mg/kg,IP麻醉。手术显微镜下，颈部正中切开，分离右颈总动脉，用5～0号进口尼龙线约10～12 mm 长，头端涂用cilicon,插入颈内动脉抵大脑中动脉的起始端。判断标准为：右侧Horner's征，左侧肢瘫。分别于缺血术后 6、12、24 h断头取脑，在冰上(缺血侧和非缺血侧半球)迅速分离大脑皮层、海马、脑干、丘脑(纹状体)。 1.2 RNA提取和逆转录成cDNA 用Trizol(Gibco公司) 50～100 mg/ml提取总RNA。溶解在10μl RNase-free dd-H2O中，65℃ 5 min,冰浴中5 min。然后加Depc-H2O+ Rasin 1 μl+Amv 5·buffer 5μl+dNTP 2 μl+primer 2μl+ Amy 2μl,置25℃水浴10 min,42℃，2 h,逆转录成cDNA。 1.3 PCR扩增、ELISA定量 The biosource cytoexpress TM mouse imterleukin-6 kit(Roche公司),IL-6引物和内校正标准(ICS)试剂盒中提供。10μl 10*buffer+16 μl dNTP stock+2 μl primer pair(25 pmol/μl)+61.5 μl water,95℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环，72℃ 10 min,置 4℃冷却。PCR(加入植物素标记的引物),在此之前加入扩增产物，变性后用杂交缓冲液稀释成不同浓度加入ICS和 IL-6寡核甘酸包被的微量板中，加入底物和HRP变色，在酶标仪上测定OD值。内标准物(ICS)结构与IL-6相似，但两者只能对包埋板上的ICS或IL-6其中一种核酸序列进行杂交。 PCR产物变性，根据下列公式计算IL-6的量：总的IL-6 OD/总的ICS OD× 2×插入的ICS复制数 1.4 统计学方法 t检验。