基于SrtA介导酶促连接的重组B型肉毒毒素制备
赵明明
王志波
于琦
柴闯
梁浩然
王瀚琦
任洪林
吉林大学 动物医学学院/人畜共患传染病重症诊治全国重点实验室/人兽共患病研究教育部重点实验室/人兽共患病研究所,吉林 长春 130062
摘要：为建立安全高效的B型肉毒毒素(BoNT/B)制备技术体系,采用原核表达方法,将BoNT/B拆分为轻链及重链N端结构域(LHN)与重链C端结构域(HC).在LHN蛋白C末端引入LPETG五肽序列、HC蛋白N末端引入甘氨酸(Gly),分别构建pET-32a-LHN与pET-28a-SUMO-HC原核表达载体,诱导表达并纯化获得LHN和HC重组蛋白;利用分选酶A(SrtA)介导的转肽反应,实现LHN与HC的体外共价偶联,制备重组BoNT/B.为评价重组BoNT/B的毒力,将18只雌性KM小鼠随机平均分为6组(n=3),分别腹腔注射质量浓度为200、100、10、1、0.1 µg/mL的重组BoNT/B,以明胶磷酸盐缓冲液为阴性对照,连续观察96 h内小鼠发病及死亡情况.结果表明,在表达、纯化及标签切除后,LHN与HC蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,分别在约98.67、52.15 ku处出现特异性条带;在SrtA催化下,二者可成功偶联形成分子质量约150.82 ku的重组BoNT/B.小鼠毒力试验表明,重组BoNT/B具有明显神经毒性,质量浓度≥1 µg/mL的重组BoNT/B可使小鼠出现典型肉毒中毒症状并致死,质量浓度<1 µg/mL组与对照组未出现小鼠死亡的情况.综上,成功构建pET-32a-LHN与pET-28a-SUMO-HC表达载体,二者均可在大肠杆菌原核表达系统内高效表达;纯化后的LHN与HC结构域蛋白可在SrtA的催化下偶联形成重组BoNT/B;小鼠攻毒试验证实,所制备的重组BoNT/B具有神经毒性.
关键词：B型肉毒毒素原核表达分选酶A分选酶A介导的共价偶联神经毒性
分类号：S852.61(动物医学（兽医学）)
资助基金：中央高校基本科研业务费专项(45121031B007)国家重点研发计划(2021YFC2600202)
论文发表日期：2026-06-15
在线出版日期：2026-09-12（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：9( 132-140 )
英文信息