辣椒轻斑驳病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立
赵振兴1
范奇璇2
王思元1
董铮1
胡中泽3
张永江1
1.中国检验检疫科学研究院,北京 1001762.中国检验检疫科学研究院,北京 100176;中国农业大学 植物保护学院,北京 1001933.江苏省农业科学院 泰州农科所,江苏 泰州 225300
摘要：辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全.为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase-aided amplification,RAA),设计了特异性RAA引物,实现对PMMoV的快速等温扩增,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物.优化结果显示,总反应体系在报告基因FQ终浓度为400 nmol/L,Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol/L和1 000 nmol/L条件下检测信号最强,最终的RT-RAA反应和CRISPR显色体系分别仅需15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号.该方法可特异性检测PMMoV,对携带PMMoV的辣椒样品RNA的检测极限可达到1.34 pg/μL,分别是普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测灵敏度的1 000倍和10倍.对实际样品中的检测结果显示,建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在PMMoV侵染的辣椒和番茄叶片、果实及土壤中检测到PMMoV,可用于辣椒轻斑驳病毒的快速、灵敏、可视化检测.
关键词：辣椒轻斑驳病毒RT-RAACRISPR/Cas12a可视化检测
分类号：S432.4+1(病虫害及其防治)
资助基金：国家重点研发计划(2021YFD1400100)国家重点研发计划(2021YFD1400103)
论文发表日期：2024-09-15
在线出版日期：2026-09-12（本平台首次上网日期，不代表文献的发表时间）
页数：8( 80-87 )
英文信息